• The effect of microbial communities in soil on arsenic release was investigated.

• The presence of diverse indigenous bacteria led to higher arsenic release.

• Microbial communities appear to play a significant role in the geochemical behavior of arsenic.

토양 내에 서식하는 미생물은 양(abundance)과 종류(species)로 표현되는 ‘다양성(diversity)’을 보이는 군집(community)을 이루며 존재한다. 이러한 군집 구조는 탈수, 영양조건, 토양의 물리적 교란 등 외부 환경변화에크게 좌우되는 동시에(Torsvik et al., 2002), 미생물 종간의 협조(항진, cooperation) 또는 경쟁(길항, competition, antagonism) 관계에 의해서도 결정된다. 현재 특정 토양에 서식하는 미생물 군집은 부여된 환경 조건에서 진화적으로 가장 안정한 군집이라 할 수 있다.

DNA 염기서열 분석의 발달을 통하여 ‘배양은 어려우나 식별이 가능한’ 세균을 특정할 수 있는 기술이 발달하며 마이크로바이옴(microbiome) 연구가 활발히 수행되고 있다. 특수한 기능을 보유한 단일 미생물 종에 초점을 두었던 기존 연구는 이제 다양한 미생물들과 그 유전정보의 집합체인 마이크로바이옴을 연구하는 방향으로급속히 전환되고 있다.

토양 등 지질환경에 대해서도 철환원균인 Geobacter, Shewanella 및 황산염환원균(SRB; sulfate reducing bacteria)등 원소의 산화환원전위를 변화시키는 특수 기능을 보유한 단일균의 역할 규명에 초점이 맞춰져 있던 기존 연구는 이제 그들과 같이 공존하는 미생물 생태계의 상호작용을 파악하는 방향으로 전환되고 있다(Mawarda et al., 2020). 이는 특수한 목적을 위해 외래 미생물 종을 인위적으로 지질 매체에 접종하였을 경우, 토착균(indigenous bacteria)과의 상호작용, 즉 길항, 항진 또는 비영향 등을고려해야만 이 특수 미생물을 접종한 소기의 목적을 달성할 수 있음을 나타낸다.

국내에서도 토양수 내 중금속을 황화물 형태로 침전,안정화하기 위하여 외래 SRB를 중금속 오염 토양에 인위적으로 접종하거나 또는 토착 SRB를 활성화하기 위하여 SO₄^2- 및 특정 탄소원을 토양에 투여하는 연구가 시도된 바 있다(Song et al., 2007; Ko et al., 2009; Jang et al., 2009; Kim et al., 2011). 연구 결과, 다른 미생물의영향이 없는 실험실 조건에서 SRB의 중금속 침전 효과를 확인하였음에도 불구하고, 실제 현장 토양에 이를 접종한 경우에는 중금속 안정화 효과가 매우 부지특이적(site-specific)으로 발생하는 경우가 많았다. 이는 토양 내중금속의 거동이 토양의 물리·화학적 성질의 차이는 물론 특수한 기능을 갖는 단일균 뿐만 아니라 공존하는 토착균 마이크로바이옴의 영향을 받기 때문인 것으로 보인다. 특정 미생물 종이 실험실에서 발현한 결과가 중금속으로 오염된 실제 토양 환경에서도 동일하게 재연될 것으로 보기 힘들며, 이는 토양 내 중금속 거동을 조절하기 위하여 복잡한 토양 미생물 생태계를 인위적으로 조절한다는 것이 매우 어려움을 나타낸다.

토착 미생물 군집에 외래 미생물을 접종한 외국의 연구로는 광산지역 토양 생태계 복원을 위한 인위적인 외래 미생물군 접종(Moreina-Grez et al., 2019), 식물 성장에 미치는 외래 Rhizobium 접종 효과(Maste et al., 2020),인위적인 미생물의 접종으로 식물의 수확량과 품질을 향상시키며 종의 다양성이 증가함을 보임으로써 미생물 간상호작용의 중요성을 나타낸 연구(Lee et al., 2022) 등이있다. 또한 외래 식물 식재가 토양 미생물 군집구조를 변화시키거나(Perdomo-González, et al., 2023), 반대로 토양미생물 또는 마이크로바이옴 접종이 식물 생장에 영향을미친다는 연구(Smith et al., 2018; Lutz et al., 2023)도 수행된 바 있다. 반면 비소 등 독성원소의 거동에 미치는토양 미생물 군집에 관한 연구는 매우 드물며, 이에 관해서는 작물과 연관된 마이크로바이옴과 중금속 간의 상호작용(Rizvi et al., 2022; Jiao et al., 2019)에 관한 연구등을 들 수 있다. 국내에서는 외래 미생물 접종 후 미생물 군집구조 변화 및 이의 중금속 거동에 관한 지구화학적 영향은 수행된 적이 거의 없다.

이 연구에서는 중금속 오염 토양 내 미생물 군집 차이에 따른 비소의 지구화학적 거동 변화를 조사하였으며또한 인위적으로 외래균을 접종하였을 때 토착 마이크로바이옴에 어떠한 변화가 나타나는지를 파악하려 하였다.이를 위하여 비소로 오염된 광산 주변 토양의 화학적 특성을 조사하고 특성별로 세 가지 토양을 선별한 후 토양환경에서 널리 분포하는 미생물인 Bacillus fungorum을시료에 따라 인위적으로 접종하였다. 배양 중 시간에 따라 pH, 산화환원전위 및 비소와 철 용출량과 미생물 군집구조의 변화를 관찰하였다.

2.1. 토양 시료 채취 및 화학적 분석

토양 시료 채취 장소는 중금속에 의한 오염이 예상되는 금속광산 주변 농경지 토양으로 선정하였으며, 전라남도 광양시 4개 광산, 보성군 5개 광산, 화순군 2개 광산 인근 2 km 이내 논에서 총 49개의 표토 시료를 채취하였다.

토양의 화학적 특성 파악을 위하여 자연 건조한 토양을 –80 mesh(<0.18 mm)로 체거름한 후, pH, 양이온교환능력(CEC; cation exchange capacity), 유기물(OM; organic matters) 함량을 측정하였다. 토양 pH는 토양을 탈이온수로 1 시간 진탕한 후 60초 이내에 측정하였다(Hanna Instruments, USA). CEC는 Busenberg and Clemency(1973)를 따라 Na 치환법으로 수행하였다. OM은 105 °와 550 °조건에서 각각 1시간 및 4시간 가열한 작열감량(LOI; loss-on-ignition) 측정을 통해 계산하였다(Boyle, 2004).

토양을 왕수로 분해한 후 ICP-MS(Agilent, USA) 및ICP-OES(Spectro Genesis, Spectro, Germany)를 이용하여비소, 철, 구리, 아연을 정량하였다. 이때 ISO 인증 표준물질인 BAMU110(CRM BAM-U110, BundesAnstalt für Materialforschung, Germany) 시료 및 일부 중복시료(duplicate)를 삽입하여 분석의 정확도 및 정밀도를 검증하였다. 또한 환경 변화에 대하여 용이하게 용출되는 중금속의 함량을 파악하기 위하여 Mehlich3 용액을 이용하여 토양을 단일 용출하였다. Mehlich3 용액은 아래와 같이 제조하였다.

i) Stock solution M-3: 55.56 g NH₄F + 29.23 g EDTA in 1 L deionized water

ii) Mehlich solution: 200.1 g NH₄NO₃ + 100 mL stock solution M-3 + 115 mL CH₃COOH + 82 mL 10%HNO₃ in 10 L deionized water

Mehlich3 용출은 체거름한 토양시료 0.5 g에 Mehlich3용출액 5 mL을 주입하고 120 rpm으로 5분간 교반하여용출하였다. 용출 후 원심분리(4,000 rpm, 5 min)하여 상등액을 취해 0.45 μm 필터로 여과하였으며 여과액은 ICP-MS를 이용하여 비소, 철, 구리, 아연을 정량하였다.

채취한 49개 토양의 화학적 분석 결과를 바탕으로 서로차이가 나는 특성을 보이는 토양 3개를 선별하였다(시료명 F1, G7, G10).

2.2. 마이크로바이옴 분석 및 외래균 접종

(주)마크로젠에 의뢰하여 토양 시료 내 미생물 군집구조를 파악하였다. 마크로젠의 Miseq(Illumina, Inc.) 장비를 이용하여 미생물의 16S ribosomal RNA 마커 유전자의 특정 영역인 V3-V4 영역을 증폭하여 제조사의 방법으로 분석을 수행하였다.

접종할 외래균으로는 실험실에서 계대배양 중이던B. fungorum을 접종하였다. 그램양성 간균인 B. fungorum은 토양에서 흔히 분리되는 종으로서 다른 Bacillus 속(genus)과 동일하게 내생포자(endospore)를 형성하는 혐기성균 또는 통성(facultative) 혐기성균이다. 최근 기존에 B. cereus로 알려졌던 종의 일부가 B. fungorum으로 새로분류된 바 있으며(Liu et al., 2020), (주)마크로젠에 의뢰하여 실험실에서 배양 중이던 B. cereus의 16S rRNA를분석한 결과 B. fungorum으로 분류되었다. Jain et al.(2011)은 B. cereus로부터 비소 독성에 내성을 갖는 arsC 유전자를 분리한 후 그 단백질 구조를 연구한 바 있으며, Miyatake and Hayashi(2011)는 B. cereus에 의한 용존As(V) 및 As(III)의 흡착성 제거에 관하여 기초적인 실험을 수행한 바 있다. 최근에는 계통발생학적으로 B. cereus그룹에 속하는 것으로 보이는 strain IIIJ3-1이 As(V)는 물론 Fe(III), SO₄^2-, NO₃^-, Se(VI) 등을 전자수용체로 사용하며 생장한다는 보고가 있었다(Ghosh et al., 2020).

B. fungorum은 marine broth 배양액을 이용하여 계대배양 하였다. Marine broth의 조성은 다음과 같다; peptone 5.0 g/L, yeast extract 1.0 g/L, NaCl 19.45 g/L, MgCl₂ 5.9 g/L, CaCl₂ 1.8 g/L, KCl 0.55 g/L, KBr 0.08 g/L, Fe(III) citrate 0.1 g/L, MgSO₄ 3.24 g/L, NaHCO₃ 0.16 g/L. B. fungorum은 통성혐기성균이므로 세럼병(serum bottle) 내의 배양액에 N₂ 가스를 이용하여 20분간 퍼징(purging)하여 산소를 제거하고 28 °, 150 rpm 조건에서 배양하였다. 실험에 사용한 배양액과 기기는 고압멸균하였으며 N₂ 가스는멸균된 주사기 바늘과 0.2 μm 필터를 이용하여 주입하였다.

선별한 토양 3개(F1, G7, G10)에 B. fungorum을 접종하여 시간에 따른 총 비소, As(III), 철의 거동을 살펴보았다. 이를 위하여 균질하게 섞은 세 종류의 젖은 토양 10 g에 지수성장기의 B. fungorum 배양액 5 mL을 접종하고 탄소원으로서 유산염(lactate) 2%를 포함한 marine broth배지 50 mL을 주입한 후 혐기 환경에서 다음 조건에 따라 배양을 진행하였다; ① BAC 시료: 멸균토양 + B. fungorum, ② IND 시료: 비멸균 토양(토착균 군집), ③ MIX 시료: 비멸균 토양 + B. fungorum. 토양 멸균은 고압멸균기(autoclave)를 이용하여 120 °에서 20분간 1회살균하였다. 그러나 추후 BAC 시료에 대한 미생물 군집분석 결과, 배양 시간이 경과하며 접종한 Bacillus 이외에 Clostridium 등 일부 박테리아가 점차 활성화된 것이 확인되었다. 이는 토양 시료에 대해 120 °에서 20분간1회 고압멸균 과정을 수행하여도 토착균이 완전히 멸균되지 않을 수도 있음을 나타낸다. 그러나 BAC 시료에서나타나는 미생물의 종수는 풍부한 다양성을 보이는 IND및 MIX 시료에 비하여 극히 적게 나타났다(아래 ‘결과및 해석’ 참조).

배양은 약 7주간 진행되었으며 1주, 2주, 7주에 멸균된주사기를 사용하여 상등액 시료를 채취하여 pH, 산화환원전위(Eh), 총 비소, As(III), 총 용존 철을 분석하였다. As(III)의 함량은 LC-SAX(Supelco, USA)를 통과한 함량으로 하였다. 반응 후 잔류 토양을 채취하여 냉동 보관후 (주)마크로젠에 의뢰하여 차세대염기서열분석(next generation sequencing)을 이용하여 미생물 군집 구조를파악하였다.

3.1. 토양 시료의 화학·미생물학적 특성 분석

채취한 토양 시료 49개 중 비소의 1지역 토양오염 우려기준(25 mg/kg)을 초과한 시료는 총 8개였으며, 구리(150 mg/kg) 및 아연(300 mg/kg)의 경우는 우려기준을초과한 시료가 없었다. 토양 시료의 화학적 특성 결과를기초로 실험에 사용할 대표 토양 시료 3개(F1, G7, G10)를 선별하였다. F1 시료는 높은 구리 및 아연 함량, G7시료는 낮은 pH 및 중간 농도의 중금속 함량, G10 시료는 높은 비소 함량 및 낮은 철 함량을 대표하는 것으로하였다(Table 1).

Table 1 . The physicochemical properties of the studied soil samples.

Soil Properties		Soil F1	Soil G7	Soil G10
pH		6.3	5.7	5.8
CEC (cmolc/kg)		24.0	19.0	17.7
LOI (%)		9.7	8.5	7.9
Aqua regia extraction (mg/kg)	As	31	23	35
	Cu	94	27	17
	Zn	124	81	68
	Fe(%)	3.8	3.1	1.6
Mehlich 3 extraction (mg/kg)	As	6	5	7
	Cu	19	5	4
	Zn	25	16	14
	Fe	7,696	6,193	3,215

각 토양 내 토착균으로 구성된 미생물 군집을 목(order)수준에서 상위 10개를 관찰한 결과, 세 토양 모두 월등한 우점목 없이 다양한 종류의 미생물이 존재하는 것으로 나타났다(Fig. 1). Nitrospirales, Verrucomicrobiales, Anaerolineales, Rhodocyclales, Nitrosomonadales 등은 세 토양에서 공통적으로 우점목으로 존재하였다. 이를 다시 문(phylum) 수준에서 구분하면, F1 토양은 Proteobacteria(23.0%)가 가장 많고, 이어 Nitrospirae(5.0%), Verrucomicrobia(4.6%), Chloroflexi(4.3%), Acidobacteria(3.3%) 순으로 존재하였다. G7 토양은 Proteobacteria(24.7%), Bacteroidetes(8.9%), Chloroflexi(6.5%), Nitrospirae(5.4%), Cyanobacteria(5.3%),

Figure 1. Microbial taxonomic composition of the studied soil samples at order level.

Verrucomicrobia(4.9%) 순, G10 토양은 Proteobacteria(28.6%), Nitrospirae(6.3%), Chloroflexi(5.9%), Bacteroidetes(5.3%), Verrucomicrobia(4.5%) 순으로 나타났다. 세 토양에서 모두 Proteobacteria 문이 가장 많이 서식하고, F1 토양에서는 Acidobacteria, G7 및 G10 토양에서는 Bacteroidetes가나타나는 것이 특징적이었다. 그러나 이들 박테리아는 모두 호기성 환경에서 우점하는 것들로서 추후 혐기적 조건에서 7주간에 걸친 실험 결과, 미생물 생태계는 혐기환경에 적응한 것들로 크게 변화하였다. 배양 실험 1주경과 후, 실험전 토양에 존재하던 미생물 중 F1 토양의경우 Nitrosomonadales, G7 토양의 경우 Anaerolineales, Nitrosomonadales, Burkholderiales, G10 토양의 경우Nitrosomonadales 만이 상위 10개 목에 존재하였다(아래Fig. 5(b),(e),(h) 참조).

Figure 5. Microbial community changes at order level.

3.2. pH와 산화환원전위 변화

멸균 토양에 외래균으로서 B. fungorum을 접종한 시료(BAC), 멸균하지 않아 토착균이 보존된 시료(IND), 멸균하지 않은 토양에 B. fungorum을 접종한 시료(MIX)로 나누어 약 7주간 배양하며 pH와 산화환원전위 변화를 관찰하였다.

외래균 접종 후 시간의 흐름에 따른 pH 변화를 관찰한 결과, BAC, IND, MIX 시료 모두 pH가 증가하는 경향을 보였다(Fig. 2). 7주간의 반응이 진행된 후, F1 토양은 초기 pH 6.3에서 6.5~7.0, G7 토양은 초기 pH 5.7에서 6.6~6.9, G10 토양은 토기 pH 5.8에서 6.7~7.2로 증가하였다. 실험 중 시료에서 특유의 강한 암모니아 냄새가나는 것으로 보아, pH 상승은 토양 내 유기물의 분해산물인 아미노산이 대사되며 수소이온이 소모되는 암모니아화작용(ammonification)에 의한 것으로 보인다(Lee and Beveridge, 2001).

Figure 2. Changes in pH of the soil samples over time.

시간에 따른 Eh 변화를 관찰한 결과, F1과 G7 토양에서는 7주차 BAC 시료에서 24~45 mV를 보인 반면, IND와 MIX 시료에서는 -20 ~ -54 mV로 더 낮은 환원상태에 있는 것으로 나타났다. 반면 G10 토양의 경우, 7주차BAC 시료에서는 -15 mV를 보인 반면 IND와 MIX 시료에서는 14~54 mV로 다소 높은 값을 나타냈다. 토양 내존재하는 토착균 군집 및 외래 접종균이 이러한 pH 및Eh 변화에 영향을 미친 것으로 보이나 현재로서는 이러한 변화를 유발한 여러 미생물의 복잡한 대사경로를 파악하기는 어렵다.

3.3. 비소와 철의 용출 특성

시간에 따른 비소 용출 결과에 의하면, 7주차에 G10 > F1 > G7 순으로 높은 함량의 비소가 용출되어, 대체적으로 토양에 원래 존재하는 비소 함량(G10 35 mg/kg, F1 31 mg/kg, G7 23 mg/kg)이 반영된 것으로 보였다(Fig. 3(a),(c),(e)). 또한 높은 pH에서 이동도가 증가하는 비소의 지구화학적 특성상 이는 7주차의 각 토양 슬러리 pH가 일정 부분 영향을 미쳤을 것이다(Fig. 2). 한편 왕수로분해한 토양 내 비소에 대한 IND와 MIX 시료 내 용출비소(× 1,000)의 함량비를 7주차 기준으로 보았을 때, G10 토양은 37.6~49.6으로 F1 토양 14.3, G7 토양 8.5~10.0보다 월등히 높게 나타났다(Fig. 3(a),(c),(e)). 이는 G10 토양의 경우, 토양 내 높은 비소함량이 pH 등에 의한 물리 · 화학적 조건에 의해 비례적으로 용출된 것뿐만이 아니라세균 군집의 추가적인 영향이 있었을 것으로 추정한다.

Figure 3. Variation in (a, c, e) dissolved AsTot (bar) and As(III) (dot) and (b, d, f) dissolved Fe concentrations over time. The numbers over each bar represent the ratios of As content observed in the soil samples after bacterial cultivation in the 7th week (× 1,000) to As content after aqua regia digestion of the soil.

특기할만한 점은 7주 경과하였을 때 세 토양 모두 1회고압멸균한 토양에 B. fungorum을 주입한 BAC 시료에비하여 토착균을 활성화한 IND와 MIX 시료에서 더 많은 양의 비소가 용출된 점이다. 이는 다양한 미생물 군집을 갖는 토착 미생물군이 한정된 수의 미생물 군집을갖는 토양에 비하여 토양으로부터 비소를 용출하는데 더효과적으로 기능함을 나타낸다. 또한 이는 토양 내 존재하는 토착균 종류의 차이에도 기인한 것으로 추측된다.예를 들어, 비소 용출함량이 높은 F1과 G10의 7주차 IND와 MIX 시료에는 Sporosarcina 속이 높은 비율로 존재하였으나 G7에는 이 미생물이 발견되지 않았다. Sporosarcina 속이 비소 용출을 증진한다는 보고는 없으나 비소 용출메커니즘에 직접적으로 관계하기보다 비소를 용출할 수있는 다른 토착균의 기능을 활성화하는 대사경로를 가지고 있을 수 있다.

토양 내 SRB에 의한 황산이온(SO₄^2-) 환원 및 그에 따른 비소의 황화물 형성도 한 가지 원인이 될 수 있다. 비소의 경우, SRB에 의해 형성된 S^2-와 결합해 삼황화비소(As₂S₃)를 형성하며 침전할 수 있다(Newman et al., 1997).각 토양 시료의 토착균에 대한 유전자 분석 결과, Clostridium thiosulfatireducens가 존재하는 것이 발견되었는데, SRB로 분류되는 C. thiosulfatireducens는 SO₄^2-를 직접 전자수용체로 이용하지는 않으나 황 또는 아황산이온(S₂O₃^2-)을 황화물로 환원시키는 화학적 과정을 수행하는 것으로보고된다(Hernández-Eugenio et al., 2002). BAC, IND, MIX 시료에서 2주차까지는 전체 박테리아종 중 7.0%~51.5%의 높은 점유율을 보였으나 7주차에는 0.3%~1.3%까지감소하였으며 이 시기에 비소의 용출량이 크게 증가한것을 보면 이 박테리아가 비소 거동을 조절하는데 일정부분 관여하였을 수도 있다.

비소의 화학종 분석 결과에 의하면, 1주차에는 모든 토양에서 총 용존 비소의 대부분은 As(III) 형태로 존재하였다(Fig. 3(a),(c),(e)). F1 토양의 7주차 경우, BAC 시료는 총 용존 비소 중 As(III)가 차지하는 비율이 약 47%이었으며 IND와 MIX 시료에서는 79~80%를 나타내었다. G7 토양 7주차에서는 BAC 시료의 경우 대부분의 용존비소가 As(III) 형태로 존재하였고, IND와 MIX 시료에서는 56~72%의 As(III)/As_Tot 비율을 보였다. 반면 G10토양의 시간에 따른 비소 화학종 변화는 다른 두 토양과다소 상이한 특징을 보였다. 7주차에 이르렀을 때 BAC시료에서는 약 14%의 낮은 As(III) 비율을 보였으며 IND와 MIX 시료에서도 25~29%의 낮은 비율을 나타내었다. G10 토양에서 총 용존 비소 중 As(III) 이외에 가능한 화학종은 As(V) 형태를 들 수 있으나 이외에도 다량의 유기비소(organoarsenical)의 형태로 존재하여(Xue et al., 2022) 음이온 분리 카트리지인 LC-SAX를 통과하였을 가능성도 있다. 이러한 차이의 정확한 원인을 알기 어려우나 세 토양 간의 물리적·화학적 특성 및 토착균 차이와외래균 접종의 효과 등이 복합적으로 작용한 결과인 것으로 생각되며, 이는 토착 미생물의 활성화 및 외래균에의해 토양 내 비소의 화학종이 다양하게 변할 수 있음을나타낸다.

용존 철의 용출량을 살펴본 결과, F1 토양에서는 1주차에 11~44 mg/L, 2주차에 47~214 mg/L, 7주차에192~387 mg/L의 철이 용출되었으며 BAC 시료 7주차에가장 높은 함량을 보였다(Fig. 3(b),(d),(f)). G7 토양의 경우 IND와 MIX 시료의 7주차에서 369~369 mg/L의 용출량을 보여 다른 시료(14~132 mg/L)에 비해 월등히 높았다. 그러나 G10 토양에서는 토착균을 활성화한 시료인IND와 MIX에서 7주차에 적은 양의 철이 용출되는 양상을 보여 다른 두 시료와 구별되었다.

철 (수)산화물은 비소를 비롯한 다른 금속류를 흡착하므로, 철 (수)산화물이 용해되어 용존 철 함량이 증가하면 용존 비소의 함량도 역시 증가할 것으로 예상할 수있다. F1과 G7 토양의 경우 용출된 비소와 철 간의 상관계수가 각각 0.74 및 0.86에 이를 정도로 높아 용존 철과비소의 거동이 상관관계가 있는 것으로 보였다. 그러나G10 토양에서는 비소-철 상관계수가 0.10으로 매우 낮게나타나, 비소 용출이 철 (수)산화물의 용해 이외의 다른원인으로 증가하였음을 알 수 있었다.

모든 F1, G7, G10 토양에 대하여 미생물의 다양성이극히 적은 BAC 시료의 경우 0.47의 상관계수를 보여 철산화물에 흡착 또는 공침전되어 있는 비소가 일부 화학적으로 용출되었음이 예상되나, 미생물 다양성이 높은IND와 MIX 시료의 경우 각각 –0.06 및 –0.22의 매우 낮은 상관계수를 보임으로써 다양한 미생물이 관여하는 경우 철과 비소의 지구화학적 거동이 일치하지 않음을 나타내었다. 이는 그간 널리 연구되어 온 Geobacter 및Shewanella 등 단일 미생물을 대상으로 수행하여 온 철환원균에 의한 철의 환원성 용해와 그에 수반되는 비소용출이 다양한 미생물 군집이 존재하는 자연 환경에서는발생하지 않을 수도 있음을 의미한다.

3.4. 미생물 다양성의 변화

1, 2, 7주에 채취한 각 토양별 BAC, IND, MIX 시료내 미생물 군집의 다양성 결과를 Fig. 4에 나타냈다. BAC시료에 대해서는 2주까지만 분석하였다. DNA 시퀀싱 결과에서 유사한 시퀀스들을 종들끼리 묶는 분류학적 단위인 ASV(amplicon sequence variant) 분석 결과, F1, G7, G10 토양의 BAC 시료에는 멸균 후 B. fungorum을 단독으로 주입하였음에도 불구하고 ASV 값은 12~40을 나타내어, 실험 시 토양을 1회 고압멸균하였으나 1회로는 토양 내 모든 미생물이 완전하게 멸균되지 않은 것으로 보인다. 한편, BAC 시료에 비하여 1, 2주차에 월등하게 높은 ASV 값을 보인 IND와 MIX 시료 모두 7주차에는 급격하게 낮아진 것이 특징적이다(Fig. 4(a)). 이는 아마도닫힌 계에서 주어진 환경, 예를 들면 탄소원으로 공급한유산염 등에 적응하는 박테리아가 우점하며 생물량을 증가시킨 반면 그렇지 못한 종들은 사멸하였기 때문으로보인다.

Figure 4. Bacterial community diversity of the studied soil samples. w: weeks.

Shannon index는 값이 클수록 토양 내 미생물의 풍부도와 균등성(evenness)이 큰 것을 의미한다. 우점도 지수인 Gini-Simpson index는 1에 가까울수록 고르게 분포되어 있어 다양성이 높은 것으로서, 값이 클수록 소수의 종에 의해 강하게 우점되어있지 않다는 의미이다. 이들 결과에서도 모든 토양의 IND와 MIX 시료는 7주차에 이르러 종의 다양성이 크게 감소하는 경향을 보임으로써 일부 주어진 환경에 적응한 종들만이 번성하고 있음을 나타내었다(Fig. 4(b)).

미생물의 군집 변화를 목(order) 수준에서 각 토양 내상위 10개의 박테리아를 정리하여 Fig. 5에 나타내었다.반응 전 관찰되었던 토착균 우점종의 구성은 반응 후 1주만에 완전히 변화하였으며, 이는 실험이 혐기적 조건에서 진행되며 편성 및 통성 혐기성균만 생존하였기 때문이다. 또한 토착균이 존재하는 MIX 시료에서 인위적으로 접종한 B. fungorum은 F1, G7, G10 토양 시료에서2주차까지는 상위 5위 내에 존재하였으나 7주에는 모두소멸한 것이 관찰되었다. 한편 Fig. 4와 5를 결부시켜 살펴볼 때, 시간이 경과하여 7주에 도달할수록 미생물 다양성은 대폭 감소하였으며 상위 10개 박테리아가 전체미생물 종수를 설명하는 비율은 증가하여, 소수의 미생물이 극심한 우점 상태를 보였다. 이는 혐기적 조건에서유산염을 탄소원으로 사용하는데 최적의 적응성을 보이는 소수의 박테리아가 다른 종들을 압도하며 우점하는상태를 나타낸다.

모든 토양의 BAC 시료에서는 IND와 MIX에 비하여상대적으로 간단한 미생물의 목 분포를 보였다(Fig. 5(a),(d),(g)). F1 토양의 경우, 1주차에 Eubacteriales가 73%, Bacillales가 26%를 차지하였다가 2주차에는 99% 이상이Bacillales인 것으로 나타났다. 이를 속(genus) 수준으로보았을 때, 1주차에 Eubacteriales는 대부분 Romboutsia(43%), Clostridium(24%), Bacillales는 Mesobacillus(14%), Bacillus (12%)가 우점하였으나, 2주차에는 Mesobacillus(47%), Bacillus(37%)로 변하여 주어진 환경에서 시간이 경과하며 Bacillales가 번성한 것으로 나타났다. G7 토양은 F1토양과 반대의 경향을 보였다. 1주차에 Mesobacillus(38%), Bacillus(37%), Lysinibacillus(23%)로서 Bacillales가 거의대부분을 차지하였으나, 2주차에는 Clostridium(47%) 및 Paraclostridium(29%) 등의 Eubacteriales가 76%를 점유하여 24%를 차지한 Bacillales에 비하여 우점하였다. G10토양의 경우 G7 토양과 유사한 경향을 보여, 1주차에는67%의 Bacillales(Mesobacillus 52%, Bacillus 13%)가 33%의 Eubacteriales(Clostridium 32%)에 비하여 많았으나 2주차에는 이러한 경향이 역전되어 85%의 Eubacteriales (Paraclostridium 82%)가 15%의 Bacillales(Lysinibacillus 8%, Mesobacillus 4%)를 압도하였다.

F1 토양의 IND 시료 경우, 1주차에 Eubacteriales(40%), Bacillales(18%)가 우점하였으며 이러한 경향은 2주차까지 유지되었다(Eubacteriales 61%, Bacillales 19%)(Fig. 5(b)). 1, 2주차의 속 수준으로 보았을 때에는 Clostridium 25% → 54%, Paraclostridium 11% → 5%, Bacillus 14%→2%로 나타났다(Fig. 6). 그러나 7주 경과 후 Enterobacterales가 49%로 우점하였으며 Bacillales가 46%로 뒤를 이었다. Enterobacterales 중에서는 Citrobacter가 36%로우점하였다. F1 토양의 MIX 시료는 IND 시료와 유사하게 1, 2주차에 Eubacteriales(46% → 53%), Bacillales(31% →18%)가 우세하였다(Fig. 5(c)). 다만 속 수준에서는 IND 시료와 다소 차이를 보여, Eubacteriales 중 Paraclostridium 20% → 3%, Clostridium 14% → 46%, Bacillales 목 중에는 1주차에 Lysinibacillus 25%, 2주차에 Cytobacillus 12%의 분포를 보였다. 7주 경과 후에는 Bacillales가 58%로 우점하였는데 이에는 Sporosarcina(14%), Mesobacillus(11%)가 주를 이루었다. 한편 1, 2주차에 우점하지 못했던Bacteroidales가 26%(Macellibacteroides 18%, Parabacteroides 8%)를 차지하여 뒤를 이었다. IND와 MIX 시료 간의 차이는 B. fungorum을 인위적으로 주입한 것이므로 이러한인위적 외래균 접종이 Bacteroidales가 번성하는 미생물생태계 조성에 기여하였을 가능성도 있다. 이외에 IND시료에서 7주차 우점목이었던 Enterobacterales가 MIX 7주차 시료에서도 13%(Enterobacter 8%)를 차지하였다. F1 토양에 대해 요약하면, IND와 MIX 시료에서 1, 2주에 최우점목이었던 Eubacteriales가 7주차에는 대폭 소멸하고, Bacillales와 Enterobacterales가 우점하게 되었으며MIX 시료의 경우에는 7주차에 Bacteroidales가 번성하게되었다. 이 때 동일한 목에 속하기는 하지만 속이 다른미생물이 주차별로 다르게 나타나기도 하였다 (Fig. 6).

Figure 6. Bacterial occupancy percentages over time from week 1 to week 7. The thickness of each line represents the percentage occupied by each of the top 10 microbial communities. (Scale width = 100%).

G7 토양의 IND 시료 경우, Eubacteriales가 1, 2주차에각각 62%, 45%로 우점하였다(Fig. 5(e)). 우점하는 Eubac-teriales를 속 수준으로 보았을 때, 1주차에 각각 23%, 22%를 차지하던 Paraclostridium과 Romboutsia가 2주차에는4%, 2%로 감소하였으며, 1주차에 14%를 차지하던 Clostridium이 2주차에는 35%로 증가하였다(Fig. 6). 7주차에는 Bacillales가 급증하여 85%를 차지하였으며, 이 때 Lysinibacillus(31%), Rummeliibacillus(28%)가 우점속을 형성하였다. G7 토양의 MIX 시료는 IND 시료와 유사하게1, 2주차에 Eubacteriales가 각각 60%, 66%를 차지하였다(Fig. 5(f)). 속 수준에서의 미생물 군집은 다소 차이를 보여 Paraclostridium(17% → 11%), Terrisporobacter(15% → 10%), Romboutsia(13% → 2%), Faecalicatena(0% → 11%)가 우점하였다. 7주차에 역시 IND 시료와 유사하게Bacillales가 56%로 급증하였으며 Eubacteriales는 7%로감소하였다. Bacillales를 구성하는 속은 Lysinibacillus(19%), Rummeliibacillus(16%), Psychrobacillus(8%)였으며 이외에 Enterobacterales인 Citrobacter가 11%를 차지하였다. G7 토양의 미생물 군집구조 변화에 대해 요약하면, IND와 MIX 시료에서 1, 2주에 최우점목이었던 Eubacteriales가 7주차에는 크게 감소하고, Bacillales가 우점하게 되었으며 MIX 시료에서는 7주차에 Enterobacterales가 IND에비하여 더 많은 비율을 차지하였다.

G10 토양의 IND 시료 경우, 1, 2주차에 Eubacteriales (50% → 60%), Enterobacterales(20→16%), Bacillales (10% → 5%)가 우점하였다(Fig. 5(h)). 속 수준에서는 Paraclostridium(26% → 22%), Clostridium(15% → 18%), Enterobacter(13% → 15%), Bacillus(5% → 1%)로 존재하였다. 7주차에는 51%의 Bacillales(Sporosarcina 25%)와 45%의 Enterobacterales(Citrobacter 29%, Kluyvera 9%, Enterobacter 7%)가 주를 이루었으며 Eubacteriales는 1% 정도로 감소하였다. G10 토양의 MIX 시료는 IND시료와 유사하게 1, 2주차에 Eubacteriales가 각각 44%, 53%를 차지하였으며 Bacillales가 각각 21%, 9%를 차지하였다. Eubacteriales는 Paraclostridium(20% → 8%), Clostridium(12% → 22%), Romboutsia(7% → 1%), Terrisporobacter(4% → 14%), Bacillales는 Mesobacillus (10% → 6%), Bacillus(9% → 2%)로 구성되었다. 한편 7주차에는 Bacillales가 76%로 급증하고 Enterobacterales가 20%로 증가하였다. Eubacteriales는 1%로 감소하였다. Bacillales를 구성하는 속은 Sporosarcina(27%), Mesobacillus(19%), Lysinibacillus(9%)이었으며, Enterobacterales는 Enterobacter(20%)로 주로 구성되었다. G10 토양은 F1토양과 미생물 구조의 변화 양상이 유사하나, 차이점은F1 토양의 경우 7주차에 Bacteroidales가 번성하였다는 점이다.

모든 토양에서 우점속으로 나타나는 박테리아 대부분은 비소의 지구화학적 거동과 직접적인 관련이 보고된적이 없는 일반 토양 미생물이다. Citrobacter의 경우 인산 리간드를 생성하여 우라늄을 침전시킨다는 것이 밝혀졌으나(Mackaskie et al., 2000) 같은 메커니즘이 비소에도 적용된다는 보고는 없다. 따라서 각 토양별로 나타나는 비소 용출량의 차이는 특정한 단일균에 의한 것이 아니며 이들 미생물 군집의 차이에서 비롯된 것으로 보인다. As(V)를 환원하며 에너지를 얻는 비소호흡(arsenate-respiring) 세균 또는 고세균으로 널리 알려진 Sulfurospirillum arsenophilum(Ahmann et al., 1994), Sulfurospirillum barnesii (Laverman et al., 1995), Chrysiogenes arsenatis(Macy et al., 1996), Desulfotomaculum auripigmentum(Newman et al., 1997), Bacillus arsenicoselenatis(Blum et al., 1998), Pyrobaculum arsenaticum(Huber et al., 2000)은 전혀 검출되지 않았으며 Desulfuromonas 속(Osborne et al., 2015)은 대부분 검출되지 않거나 극히 일부 시료에서 0.03%이하로 존재하였다.

한편 토양 내 금속의 이화적 환원 거동에 지대한 영향을 미치는 철환원균의 대표종인 Geobacter의 경우, F1 토양의 IND 시료에서 1, 2, 7주차 분포 변화를 보면 0.5% → 0.2% → 0.0%, MIX 시료에서는 0.2% → 0.2% → 0.0%, G7 토양의 IND 시료에서 0.6% → 0.3% → 0.0%, MIX 시료에서 0.3% → 0.2% → 0.1%, G10 토양의 IND시료에서 0.3% → 0.2% → 0.0%, MIX 시료에서 0.3% → 0.4% → 0.0%로 시간이 경과하며 점차 소멸하는 것으로 나타났다. Geothrix fermentans(Coates et al., 1999)의 경우, G7 토양의 IND 시료 일부에서 나타났으나 0.04%이하로 존재하였다. Shewanella는 검출되지 않았다. 이와관련하여 Lentini et al.(2012)은 탄소원으로 아세테이트를 공급하였을 경우 Geobacter sp.에 의한 철 환원이 우세하였으나 포도당 또는 유산염을 공급하였을 경우에는Enterobacter spp. 같은 발효균 및 Desulfovibrio spp. 등SRB의 작용과 철 환원이 동시에 발생함을 보여 탄소원에 따라 철 환원의 메커니즘이 변화할 수 있다고 하였다. Thermodesulfovibrio, Desulfobacca, Desulfonatronum, Desulfomonile, Desulfovibrio 속 등등 SRB의 경우, 1, 2주차에 최대 0.9%까지 존재하였으나 역시 7주차에 이르러 대부분 소멸하였다. 이러한 사실은 액체배지 실험은물론 멸균 토양에 특수 기능을 갖는 박테리아를 단독으로 접종한 후 관찰된 실험 결과는 미생물 다양성이 존재하는 자연 상태의 토양에서는 발생하지 않을 수도 있음을 나타낸다고 할 수 있다.

폐광산 주변 농경지를 대상으로 혐기적 조건에서 탄소원인 유산염을 주입한 후 멸균토양 + B. fungorum, 토착균 토양, 토착균 토양 + B. fungorum의 조건으로 7주간배양을 진행한 결과, 상이한 비소 용출과 미생물 군집구조를 보였다. 모든 토양에서 멸균토양에 B. fungorum을주입한 경우보다 토착균이 보존된 경우에 더 높은 비소용출량을 나타냈다. 또한 F1과 G7 토양에 비하여 G10토양에서 토양 내 비소 함량에 비하여 훨씬 많은 양의비소가 용출되었다. 전체적인 미생물 군집에서 우점목을차지하는 박테리아는 유사하게 나타났으나 시간에 따라분포 비율이 달라졌으며, 속 수준에서 관찰한 결과 다소의 차이가 나타났다. IND와 MIX 시료를 볼 때, F1 토양은 다른 두 토양과는 달리 Romboutsia, Terrisporobacter가 관찰되지 않았고, Cytobacillus와 Peribacillus는 F1 토양에서만 나타났다. MIX 시료의 경우에는 7주차에 Bacteroidales가 번성하였다. G7 토양의 경우, Bacillus, Sporosarcina, Kluyvera, Enterobacter, Solibacillus가 나타나지 않았고 Kurthia와 유익균(probiotics)으로 알려진Rummeliibacillus(Tan et al., 2019)는 G7 토양에서만 나타났다. G10 토양은 IND 시료에서 Citrobacter, IND와 MIX시료에서 Enterobacter가 매우 번성하였다. 현재로서는 이러한 미생물 군집의 차이가 비소의 거동과 어떠한 연관을 맺고 있는지 정확히 파악하는 것은 어렵다. 이는 토양 내 각 미생물의 대사경로가 여러 단계를 거쳐 진행되고 그 산물이 어떠한 상호관계를 갖는지에 대한 정보가극히 부족하기 때문이다. 비소의 지구화학적 거동에 미치는 미생물 군집의 영향을 세밀히 관찰하는 지속적인연구가 필요하다.

이 연구의 결과는 토양 내에서 원소의 미생물학적 반응을 파악하기 위해서는 원소 거동에 영향을 미치는 것으로 알려진 특수 미생물의 활동 이외에 다른 토착균 분포에 대한 고려가 있어야만 정확한 예측이 가능하다는것을 의미한다. 현재 활발하게 수행되고 있는 미생물군과 원소의 관계에 대한 연구가 더욱 진행될수록 실제 토양에서 발생하는 원소-미생물 간의 상호관계에 대한 정보가 축적될 것이다. 추후 더 다양한 미생물을 이용한 실험들이 진행된다면 특이적이고 유효한 마이크로바이옴을발굴하고, 이를 배양하여 실제 토양에 접종한 후 결과를관찰하는 형식의 연구도 가능할 것이다.

이 논문은 한국연구재단 지역대학우수과학자지원사업(과제번호 2020R1I1A307435913) 지원을 받아 수행하였습니다.